Isolation et stimulation des cellules B avec pluriBead

Isolation

Exemples de documents	50ml de sang total EDTA
Méthode d'isolation	Non magnétique avec 300 µl de CD19 S-pluriBeads® anti-humains
Rendement	~3,5 * 10^6 lymphocytes B
Vitalité	>99% (Coloration au bleu de trypan)
Détermination de la pureté	Coloration des anticorps anti-CD20-FITC suivie d'une analyse FACS
Pureté	~97% de lymhocytes B

Anaylsis

Détermination de la fréquence des cellules mémoire B spécifiques à l'antigène

Après activation de la cible, la fréquence des plasmocytes sécrétant des anticorps (ASC) a été déterminée via ELISpot.

Les cellules B isolées avaient été stimulées pendant 5 jours avec un mélange d'activation polyclonale. Ensuite, elles ont été cultivées sur une plaque recouverte de l'antigène spécifique. Après une incubation de 24 heures, le test avait été traité.

Les points ont été comptés et évalués avec un logiciel spécifique (AID ELISpot6.0 iSpot). Dans le diagramme ci-contre, les chiffres en bleu reflètent le nombre de taches spécifiques à l'antigène par puits.

Fig 1: Pureté des lymphocytes B isolés et stimulés

Fig 2: Analyse ELISpot des cellules spécifiques anti-Ig en double. d1d2 : 250 cellules/puits chacun, d3d4 : 500 cellules/puits chacun, d5d6 : cellules non activées (500 cellules/puits chacun)

Fig 3: d7d8: cellules Memory B spécifiques de la nucléocapside anti-influenza, d9d10 : cellules Memory B spécifiques du nti-tétanos-toxoide, d11d12 : contrôle négatif

Interprétation / Résumé

Le S-pluriBead® CD19 a permis d'isoler les lymphocytes B d'un échantillon de sang total humain avec une pureté d'environ 97%.

Les cibles isolées ont montré une vitalité de >99 % après coloration au bleu Trypan. Elles avaient été cultivées avec succès en culture cellulaire et différenciées en cellules plasmatiques sécrétant des anticorps (ASC). Les ASC se sont révélées appropriées pour l'analyse de la réponse des cellules B mémoires spécifiques à l'antigène par le test ELISpot. Les résultats ont été comparables à ceux obtenus par une méthode de référence (Dynabeads® CD19 Pan B).

Pour la méthode de référence, voir Publication: Bussmann BM, Reiche S, Bieniek B, Krznaric I, Ackermann F, Jassoy C: Loss of HIV-specific memory B-cells as a potential mechanism for the dysfunction of he humoral immune response against HIV. Virology 2010; 397(1):7-13.)