Isolamento delle cellule B e stimolazione con pluriBead

Isolamento

Materiale campione	50ml di sangue intero EDTA
Metodo di isolamento	Non magnetico con 300 µl CD19 S-pluriBeads® antiumano S-pluriBeads® da 300 µl
Rendimento	~3,5 * 10^6 linfociti B
Vitalità	>99% (Colorazione blu Trypan)
Determinazione della purezza	Colorazione anticorpale anti-CD20-FITC seguita da analisi FACS
Purezza	~97% Limociti B

Analisi

Determinazione della frequenza delle cellule B della memoria specifica dell'antigene

Dopo l'attivazione del target, la frequenza di secrezione degli anticorpi delle plasmacellule (ASC) è stata determinata tramite ELISpot.

Le cellule B isolate erano state stimolate per 5 giorni con una miscela di attivazione policlonale. In seguito, erano state coltivate su una piastra rivestita con l'antigene specifico. Dopo 24 ore di incubazione, il dosaggio era stato elaborato.

Gli spot sono stati contati e valutati con un software specifico (AID ELISpot6.0 iSpot). Nel diagramma adiacente, i numeri blu riflettono il conteggio delle macchie specifiche dell'antigene per pozzetto.

Fig 1: Purezza dei linfociti B isolati e stimolati

Fig 2: Analisi ELISpot di cellule specifiche anti-Ig in duplicato. d1d2: 250 cellule/pozzetto ciascuno, d3d4: 500 cellule/pozzetto ciascuno, d5d6: cellule non attivate (500 cellule/pozzetto ciascuno)

Fig 3: d7d8: anti-influenzale-nucleocapside specifico Memory B cells, d9d10: nti-tetano-tossico specifico Memory B cells, d11d12: controllo negativo

Interpretazione / Sintesi

S-pluriBead® CD19 ha permesso di isolare i linfociti B da un campione di sangue umano intero con una purezza del ~ 97%.

I bersagli isolati hanno mostrato una vitalità di >99 % dopo la colorazione blu di Trypan. Erano stati coltivati con successo in coltura cellulare così come differenciati agli anticorpi che secernono le plasmacellule (ASC). ASCs si è dimostrato adatto per l'analisi della memoria antigene-specifica B-Cell risposta dell'antigene tramite il saggio ELISpot. I risultati sono stati paragonabili a quelli ottenuti con un metodo di riferimento (Dynabeads® CD19 Pan B).

Per il metodo di riferimento vedi Pubblicazione: Bussmann BM, Reiche S, Bieniek B, Krznaric I, Ackermann F, Jassoy C: Loss of HIV-specific memory B-cells as a potential mechanism for the dysfunction of he humoral immune response against HIV. Virology 2010; 397(1):7-13.)